Cannabidiolbinding en negatieve allosterische modulatie op de cannabinoïde type 1-receptor in aanwezigheid van delta-9-tetrahydrocannabinol: een In Silico-studi


Translating…


De Beste Kwaliteit CBD Olie?

MHBioShop CBD Olie Specialist  


Pour la meilleure qualité d’Huile de CBD Visitez

HuileCBD.be specialiste Huile de CBD


   

  • Loading metrics

Open Access

Peer-reviewed

Research Article

  • Hery Chung, 
  • Angélica Fierro, 
  • C. David Pessoa-Mahana
PLOS

x

Abstract

Recent evidence has raised in discussion the possibility that cannabidiol can act as a negative allosteric modulator of the cannabinoid type 1 receptor. Here we have used computational methods to study the modulation exerted by cannabidiol on the effects of delta-9-tetrahydrocannabinol in the cannabinoid receptor type 1 and the possibility of direct receptor blockade. We propose a putative allosteric binding site that is located in the N-terminal region of receptor, partially overlapping the orthosteric binding site. Molecular dynamics simulations reveled a coordinated movement involving the outward rotation of helixes 1 and 2 and subsequent expansion of the orthosteric binding site upon cannabidiol binding. Finally, changes in the cytoplasmic region and high helix 8 mobility were related to impaired receptor internalization. Together, these results offer a possible explanation to how cannabidiol can directly modulate effects of delta-9-tetrahydrocannabinol on the cannabinoid receptor type 1.

Citation: Chung H, Fierro A, Pessoa-Mahana CD (2019) Cannabidiol binding and negative allosteric modulation at the cannabinoid type 1 receptor in the presence of delta-9-tetrahydrocannabinol: An In Silico study. PLoS ONE 14(7): e0220025. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025

Editor: Tiziana Rubino, Universita degli Studi dell’Insubria, ITALY

Received: April 15, 2019; Accepted: July 8, 2019; Published: July 23, 2019

Copyright: © 2019 Chung et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Data Availability: Data is available from the public repository Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.3242751).

Funding: This work has been supported by Pontificia Universidad Católica de Chile and Fondo Nacional de Desarolloro Científico y Tecnológico (FONDECYT). CDP acknowledges support from FONDECYT grant No 1150121. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Competing interests: The authors have declared that no competing interests exist.

Introduction

Up to date two cannabinoid receptors are known, namely the cannabinoid receptor type 1 (CB1R) and the cannabinoid receptor type 2 (CB2R) [1,2]. Both belong to class A G-protein coupled receptors (GPCRs) and are coupled mainly to the Gαi/0 subunit [3]. The CB1R is abundant in the central nervous system (CNS) where it participates in the regulation of a variety of physiological and pathological conditions, including brain development, learning and memory, motor behavior, regulation of appetite, body temperature, pain perception, inflammation and it is also involved in various psychiatric, neurological, and neurodevelopmental disorders [46]

Agonists and antagonists of the CB1R have been explored as therapeutic agents for pain management and obesity, however, receptor activation has been linked to episodes of psychosis and panic while its inhibition can precipitate depressive symptoms and anxiety disorders [7]. Therefore, despite its wide therapeutic potential ligands targeting the orthosteric site of CB1R have failed due to CNS-related adverse effects [5,8].

Recently, three different crystal structures of the CB1R have been solved [911]. Hua et al, first reported the crystal structure of human CB1R in complex with the antagonist AM6538 (pdb ID: 5tgz) followed by the structure of the agonist AM11542-bound CB1R (pdb ID: 5xra). Another crystal structure of the human CB1R bound to the antagonist taranabant (pdb ID: 5u09) was presented by Shao et al. As described by Hua et al, important conformational changes are observed when comparing the agonist and antagonist-bound CB1R. Relative to the antagonist-bound state, the extracellular part of helixes 1 and 2 moves inwards by 6.6 Å and 6.8 Å respectively, while in the cytoplasmic region helix 4 moves outwards by about 8 Å. Altogether these movement lead to a 53% reduction in the volume of the ligand-binding pocket and an increase in the surface area of the G-protein-binding region. Additionally, the aromatic interaction between F200 and W356 was described as a ‘twin-toggle switch’ important for receptor activation. Aromatic stacking between F200 and W356 contributes to stabilization of the receptor in the inactive state but in the agonist-bound state, rotation of transmembrane helixes (TMH) 3 and 5 disrupts this interaction [9,10]. Together these structures provide molecular insight into the CB1R and can contribute to a better understanding of underlying mechanisms and interactions of the receptor with cannabinoid system orthosteric and allosteric ligands.

Several allosteric ligands have been identified for GPCRs. The first evidence of an allosteric binding site at the CB1R that could recognize small molecules or allosteric modulators was reported in 2005 [1214]. Then onwards, an increasing number of CB1R modulators possessing pharmacological profiles different from classical agonists and antagonists has been reported [1522] (Fig 1). Allosteric sites are less conserved than orthosteric sites and show spatiotemporal specificity therefore offer the possibility of attaining safer profiles, receptor subtype selectivity and fine-tuning of receptor function [5,23]. Given the characteristic psychoactive effects of CB1R direct agonism, allosteric modulation represents a promising alternative that opens new therapeutic possibilities.

Delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) constitutes the main psychoactive component of the Cannabis plant but there is evidence that the observed therapeutic properties are not solely dependent upon the presence of THC but result from the interplay of plant cannabinoids or phytocannabinoids which participate mitigating side effects or improving the therapeutic activity [2429]. Studies with different phytocannabinoids, particularly cannabidiol (CBD) (Fig 2) have reported a possible antagonic effect of this compounds over THC in the CB1R [30,31]. These results have raised in discussion the possibility that CBD could act as a negative allosteric modulator of the CB1R. Some authors suggest this phytocannabinoid can allosterically bind to the CB1R and thereafter modulate agonist activity [31], while others support an indirect antagonism of THC effects via mechanisms not mediated by CB1R [30].

The present work aims to further explore the modulation excreted by CBD upon THC effects in the CB1R and its possible allosteric nature. In order to do so, we have used a computational approach and the recently solved crystal structures to explore the possibility that CBD acts directly on the CB1R. Here we show evidence that a putative CBD binding site is located in the N-terminal region of CB1R, partially overlapping the orthosteric binding site. We identify receptor residues that participate in CBD binding in the presence of the agonist THC, and finally, we relate CBD binding to particular conformational changes that can impair G-protein activation. Together, these results offer a possible explanation to how CBD can directly modulate effects of THC on the CB1R and contribute to a better understanding of the endocannabinoid system (ECS).

Methods

Ligand preparation

All ligands were modelled using the Spartan’14 Software (Wavefunction, Inc. Irvine, CA). Geometry optimization calculations at the Hartree-Fock level of theory using the 6-31G* basis set was carried out using software package.

Protein preparation

Previously reported CB1R crystal structures bound to agonist [10] (PDB: 5XRA) and antagonist [9] (PDB: 5TGZ) were retrieved from protein data bank. Both crystal structures were solved at 2,8 Å resolution and the CB1R sequence was modified to facilitate crystallization; flavodoxin was inserted as a stabilizing fusion partner within the receptor’s third intracellular loop (ICL3), the receptor was truncated on both the N and C-terminal, and four mutations (T2103.46A, E2735.37K, T2835.47V, and R3406.32E) were introduced to improve expression and thermostability. In order to prepare the protein structures, all co-crystallized heteroatoms, water molecules and flavodoxin protein were eliminated, missing residues and missing atoms were added and point mutations were converted back to the wild-type receptor sequence using UCSF Chimera package [32].

Receptor modeling

Missing segments in the CB1R crystal structures were modeled using the loop modeling protocol in the Software Modeller 9v12 [33]. The N-terminal membrane proximal region (MPR) was modeled from residue 89 to 103 or 98, and the ICL3 from residue 306 to 336 or 331 in the crystal structures bound to agonist and antagonists respectively using the loop.py script. The disulfide bond between C98-C107 in the MPR was also modeled model_disulfide.py script. The human CB1R sequence was retrieved from the UniProt Knowledgebase database (UniProtKB) entry P21554. 100 runs were carried out using the standard parameters and the best model was selected based on the internal scoring function implemented in the software. The selected model was externally assessed using the free available programs ProSA [34], ANOLEA [35] and Procheck [36]

Identification of binding cavities

Each CB1R generated model was mapped for potential ligand binding pockets using the web servers Computed Atlas of Surface Topography of proteins (CASTp) [37] and DoGSiteScore [38]. Out of the identified pockets only those with a volume equal or greater than CBD vdW volume (327,42 Å​3) were considered. One of the identified sites was selected for further molecular docking studies.

Molecular docking

Docking studies were performed using AutoDock v4.2 [39] software suite with AutodockTools ADT 1.5.6 [39,40] following the standard docking procedure for rigid proteins. Grid maps were calculated using the autogrid option with a grid volume of 100x100x80 points with grid spacing of 0.375 Å and centered in the previously selected binding cavity. Docking simulations were performed with a Lamarckian genetic algorithm (LGA) and binding energies were estimated according to the internal scoring function implemented by the program. 250 independent runs per ligand were carried out with an initial population of 300 individuals, a maximum number of 250.000 energy evaluations, a maximum number of 27.000 generations, a mutation rate of 0.02, and a cross-over rate of 0.80. Cluster analysis of the docking conformations was conducted using a root-mean-square-deviation (RMSD) tolerance of 2.0Å. From the resulting complexes, those with the lowest free-energy binding positions were selected and further analyzed using the Visual Molecular Dynamic (VMD) visualization program [41]. Validation of the docking protocol was preformed using the co-crystallized ligands: the agonist AM11542 in the active conformation and the antagonist AM6538 in the inactive conformation of the receptor.

System setup

Two systems were set up for MD simulations using the selected protein-ligand complexes as starting coordinates. Topology and parameter files were generated using the web server SwissParam [42]. The orientation of the receptor structures with respect to the membrane were obtained from the Orientations of Proteins and Membranes (OPM) database [43]. The protein–ligand complexes were inserted in a 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) lipid bilayer with the VMD Membrane Builder plugin and solvated in a TIP3 water box with Na and Cl ions to maintain a concentration of 0.15 M. The final system size was approximately 152 Å × 153 Å × 120 Å in the active and inactive conformations.

Molecular dynamics simulations

MD simulations were carried out in NAMD 2.9 [44] software. A 1 fs integration time step was used. Periodic boundary conditions were applied and long-range electrostatics were computed using the particle mesh Ewald algorithm [45]. For non-bonded interactions a 12 Å cutoff and a 10 Å switching distance for smoothing functions were used. Each system was energy-minimized for 10000 conjugate gradient steps. The pressure was maintained at 1 atm using the Langevin piston method and temperature was maintained at 310 K by Langevin dynamics with a damping coefficient of 5 ps−1. The simulations were carried out under the NPT ensemble with no fixed atoms. The total production time for the inactive and active receptor conformations was of 25 ns and 50 ns respectively. All trajectories were analyzed using the VMD visualization program [41].

Results and discussion

Various previous studies have shown that CBD is able to modulate THC effects in the CB1R [30]. However, its underlying mechanism remains unclear and although a possible allosteric nature has been proposed, there is no evidence of a direct interaction between CBD and the receptor. In this work, the possibility that CBD acts directly on CB1R was studied using a computational approach and the recently solved crystal structures. We first modeled the missing membrane proximal region (MPR) in the N-terminal of the available CB1R crystal structures. A putative allosteric binding site was then identified, and molecular docking studies were carried out. Finally, molecular dynamics simulations were used to analyze specific movements that could be related to structural changes described in the receptor inactivation process.

Molecular modeling of the CB1R structure

The two human CB1R crystal structures bound to agonist AM11542 (pdb ID: 5XRA) and to antagonist AM6538 (pdb ID: 5TGZ) were selected as they were crystalized under the same conditions and provided two different conformational states, active and inactive, in which CBD might show affinity. However, both crystallized structures lack the complete N-terminal and third intracellular loop (ICL3) regions and contain a series of stabilizing mutations. For this reason, two new models of the active and inactive receptor state were constructed based on the available crystal structures.

Previous reports have shown that most of the N-terminal tail can be deleted without affecting ligand binding. However, the highly conserved MPR–spanning residues 90 to 110– has shown to be essential for the receptors ability to bind ligand [4648]. Furthermore, two conserved cysteine residues in the MPR (C98 and C107) form a disulfide bond that has been linked to allosteric modulation in CB1R. The effects of the CB1R allosteric ligands Org 27569 and PSNCBAM-1 was shown to be altered by the C98-C107 disulfide [46] and the allosteric activity of CBD depended upon the presence of polar residues at positions 98 and 107 [31]. Likewise, the ICL3 of the CB1R is known to be involved in G protein coupling and activation [4951].

As expected the overall 3D structures were very similar with changes primarily due to the modelled regions (Figures A and B in S1 File). In agreement with the crystalized structures, in the agonist-bound conformation the N-terminal region lies over the orthosteric binding site extending into the extracellular side (Figure A in S1 File) while in the antagonist-bound structure it creates a v-shaped turn that projects into the ligand binding site (Figure B in S1 File). Visual inspection reveals that in both structures the conformation of the N-terminal is constrained by the intraloop disulfide bond between C98 and C107. The v-shaped turn in the MPR is locked by this disulfide bond and seems to act as a lid above the orthosteric pocket that can open up in the active state or close back in the inactive state of the receptor and thereby modulate the access into the orthosteric site (Fig 3A).

thumbnail

Fig 3. Differences observed in the CB1R models bound to agonist and to antagonist.

(A) Difference in the N-terminal region, the C98-C107 disulfide bond is shown in yellow licorice representation. (B) Different distance between the ICL3 and the C-terminal. CB1R model bound to agonist is shown in cyan and to antagonist in blue.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025.g003

Furthermore, all modelled regions (Figures A and B in S1 File) introduce mainly polar or charged amino acids which concentrate electronegative density in the extra and intracellular surfaces of the receptor. The rearrangement of the N-terminal residues in the inactive conformation exposes a larger electronegative surface in the membrane access channel which could in turn hinder further entry of lipidic molecules into the ligand binding site.

On the other hand, the modelled intracellular segment shows that the ICL3 coils inwards towards the C-terminal tail in the active conformation and turns away in the inactive conformation. This change is in agreement with the agonists-induced reduction in the distance between the ICL3 and the C-terminal that has been described in receptor activation [52] (Fig 3B).

Identification of receptor binding sites

In order to identify possible allosteric binding sites in the CB1R generated models, the web servers Computed Atlas of Surface Topography of proteins (CASTp) and DoGSiteScorer were used. Two pockets were identified in the active and inactive receptor conformation and a third cavity was observed only in the active state receptor (Fig 4). Table A in S1 File shows the volume of the identified binding sites as calculated by the webserver DoGSiteScorer.

thumbnail

Fig 4. Binding sites identified in the CB1R.

(A) Conformation of the CB1R bound to agonist. (B) Conformation of the CB1R bound to antagonist. Orthosteric site S1 (green) and potential allosteric binding sites S2 (magenta) and S3 (orange).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025.g004

Site 1 (S1).

S1 was identified in both receptor conformations and corresponds to the orthosteric binding site. Reported co-crystallized orthosteric ligands occupy this cavity and in agreement with the crystallized CB1R structures, the volume of the ligand-binding pocket is approximately 50% larger in the inactive conformation than in the active conformation [9,10,53]

Site 2 (S2).

A second possible site was found between in the intracellular side of the receptor between TMH5, TMH6 and the ICL3. This region has been associated to coupling of G-protein during receptor activation and the structure of the ICL3 bound to Gαi protein has been determined [5456]. The volume of S2 is larger in the active receptor conformation consistent with an increased surface area in the G-protein binding region during receptor activation.

Site 3 (S3).

A third binding pocket was found only in the active conformation of the receptor located in the transmembrane region between TMH3 and TMH7 and including part of the N-terminal region. This pocket sits above with the orthosteric site and has been previously reported as a putative allosteric pocket for other GPCRs [57]. The allosteric modulator ORG27569 was proposed to bind near this region where it could sterically block key electrostatic interactions involved in receptor activation [5,58].

From the three main pockets identified S1 corresponds to the orthosteric binding site and S2 can be related to the G-protein binding site. Therefore, only S3 was considered as a possible allosteric site for CBD and was selected for further docking studies. Furthermore, its location in de buurt van de MPR kan worden gekoppeld aan het gerapporteerde effect van cysteïne of polaire residuen in CBD allosterische modulatie [ 59 ]. Hoewel deze relatie werd waargenomen via functionele testen en indirecte mutagenese-onderzoeken, is er geen duidelijk bewijs van een CBD-allosterische bindingsplaats in dit gebied noch van interacties tussen CBD en de disulfidebinding.

Div> Div>

Studies naar moleculaire docking

Om mogelijke bindingsmodi en interacties van CBD in de geselecteerde te analyseren pocket moleculaire docking-onderzoeken werden uitgevoerd. Hoewel S3 niet werd geïdentificeerd in de inactieve conformatie, werd het koppelen van CBD ook ter vergelijking uitgevoerd. Omdat de geco-gekristalliseerde liganden (AM11542 en AM6538) in beide receptorconformaties analogen waren van ofwel de gedeeltelijke agonist THC of de inverse antagonist rimonabant, werd het koppelen van deze liganden in de overeenkomstige receptorconformatie eerst uitgevoerd. De resulterende koppelposities waren in goede overeenstemming met de beschreven bindwijzen voor geco-gekristalliseerde liganden met lichte variatie vanwege de gemodificeerde motieven. De verkregen eiwit-orthosterische ligandcomplexen werden vervolgens gebruikt om CBD te koppelen. Tabel B in S1-bestand toont de laagste koppelbindingsenergie verkregen voor CBD in de CB 1 R in aanwezigheid van de orthosterische liganden.

Resultaten tonen aan dat in beide receptorconformaties de laagste energiecomplexen CBD bindt naar het extracellulaire gedeelte, tussen de ECL1 en ECL3, nabij de MPR, een geconserveerd gebied dat nodig is voor ligandbinding [ 48 , 60 ] Nabijgelegen residuen ( 1 R [ 31 , 60 ].

In de agonistgebonden conformatie bindt CBD in een aan oplosmiddel blootgestelde holte in de extracellulaire zijde nabij het N-terminale gebied en boven de orthosterische plaats. Hier neemt CBD een verticale opstelling aan met de alkylketen die zich uitstrekt naar het transmembraangebied. Residuen in de buurt ( et al ., Waar mutatie van cysteïneresten naar alanine CBD-modulerende effecten heeft opgeheven maar vervanging door serine de wild-type respons herstelde. Fig 5 geeft een samenvatting van de bindingsmodus en interacties die zijn waargenomen voor CBD in de actieve en inactieve receptorconformatie.

Fig 5. Docking-conformaties van CBD in de CB 1 R.

(A) Superpositie van de actieve (cyaan) en inactieve (blauwe) receptorconformatie en vdW-weergave van CBD in respectievelijk oranje en groen. De orthosterische liganden THC en rimonabant worden weergegeven in gele stokken. (B) CBD (oranje sticks) gebonden aan de actieve receptorconformatie. (C) CBD (groene sticks) gebonden aan de inactieve receptorconformatie. Residuen in de buurt (

              https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025.g005

Anderzijds maakt CBD in de antagonist-gebonden conformatie het vouwen van de N-terminale staart mogelijk om dieper de receptor in te gaan, gedeeltelijk overlappend met de orthosterische plaats. De alkylketen van CBD is gericht op residuen F102, I105, I267 en F268 die hydrofobe contacten tot stand brengen. Net als de actieve conformatie kunnen CBD-hydroxylgroepen interacties vormen met D104 en E106, maar de disulfidebinding is verder weg (> 6Å) waardoor de waarschijnlijkheid en intensiteit van een interactie met deze residuen minder waarschijnlijk is.

Als CBD kan fungeren als een allosterische modulator van THC-effecten, dan zijn binding aan de CB 1 zou worden verwacht in aanwezigheid van een orthosterisch ligand. De identificatie van de holte S3 alleen in de actieve receptorstructuur suggereert dat allosterische ligandbinding optreedt of wordt begunstigd in de actieve conformatie gestabiliseerd door een orthosterische agonist. Dit wordt verder ondersteund door koppelingsresultaten die suggereren dat CBD kan interageren met de C98-C107-disulfidebinding in de actieve maar niet in de inactieve conformatie van de CB 1 R.

Div>

Simulatie van moleculaire dynamica (MD)

Het dynamische gedrag bestuderen van de verkregen MD-simulaties van eiwit-ligandcomplexen werden uitgevoerd.

MD in de inactieve conformatie van de CB 1 R.

De geïdentificeerde bindingsplaatsen suggereren dat CBD kan binden in de actieve conformatie van de CB R, echter, dockingstudies voorspellen een lagere bindingsenergie in de inactieve receptorconformatie. Om deze reden werd een korte 25 ns-simulatie uitgevoerd op het CBD-rimonabant-CB 1 R-complex. De specifieke doelen van deze simulatie waren: (1) observeren of de interacties tussen de receptor, de orthosterische antagonist en CBD, zoals voorgesteld door de docking-onderzoeken, gedurende de simulatie aanhielden en; (2) veranderingen in de orthosterische bindingsplaats S1 en de mogelijke vorming van een allosterische plaats S3 waarnemen.

Analyse van het orthosterische ligand rimonabant laat zien dat zijn positie blijft gedurende de simulatietijd behouden en vertoont een vergelijkbare begin- en eindconformatie (RMSD 0,675 Å). Evenzo blijven de interacties voorgesteld door dockingstudies in de simulatie en komen goed overeen met die beschreven in de antagonist-gebonden kristalstructuur van de receptor (zie Figuur C in S1 File strong>). Dit zijn voornamelijk hydrofobe interacties tussen het orthosterische ligand en residuen van de ECL2, N-terminal en alle TM’s behalve TM4 [ 9 ].

Met betrekking tot de allosterische ligand zijn positie en interacties niet behouden in de simulatie. Aanvankelijke dockingconformatie toont CBD gebonden in het N-terminale gebied met zijn alkylketen gevouwen over de orthosterische plaats, echter, gedurende de simulatie wordt gezien dat de alkylketen zich uitstrekt en draait wanneer CBD ~ 2,5Å naar de extracellulaire zijde beweegt. Deze beweging kan worden verklaard door een oplossing; simulatie onthult dat watermoleculen door de extracellulaire zijde binnenkomen en CBD solvaat dat de hydratatieschaal in het ligandenoppervlak reorganiseert. Tegelijkertijd leidt beweging van watermoleculen van het bulkoplosmiddel naar CBD-bindingsplaats de herschikking van zijn hydrofobe alkylketen als deze zich naar TMs 5 en 6 keert ( Fig 6 ).

Daarom worden de in het statische model voorgestelde interacties tussen CBD en de receptor vervangen door interacties met het oplosmiddel. In het bijzonder worden twee waterstofbruggen tussen CBD en residuen D104 en E10 vervangen voor waterstofbruggen met watermoleculen. Anderzijds laat analyse van de bindingsplaatsen zien dat de orthostische pocket S1 minimale veranderingen ondergaat en zijn totale volume behoudt (zie Tabel A in S1-bestand a > ) en S3 wordt niet gevormd tijdens de simulatietijd.

Deze resultaten suggereren dat antagonistische binding de CB heeft gestabiliseerd 1 R in een nogal rigide conformatie waarin de binding van CBD door de tijd heen onstabiel lijkt te zijn. Herschikking van watermoleculen die het allosterische ligand oplossen, lijkt een entropische kost te vertegenwoordigen die verband houdt met CBD-binding die niet wordt gecompenseerd door de interacties die met de receptor worden gevormd. Tegelijkertijd voorkomt het vouwen van de N-terminale staart over de orthosterische plaats de vorming van een pocket die CBD in dit gebied kan binden en de toegang tot de receptor blokkeert. Deze bevindingen zijn in lijn met de waargenomen modulatie-effecten van CBD op de agonist THC en ondersteunen verder dat CBD allosterische binding alleen optreedt in de actieve conformatie en in aanwezigheid van een orthosterische agonist.

Div>

MD in de actieve conformatie van de CB 1 R.

Om CBD-binding in de actieve receptorconformatie te analyseren, werd een tweede simulatie van 25 ns uitgevoerd op het CBD-CB 1 R-THC-complex. De specifieke doelen van deze simulatie waren: (1) observeren of de interacties tussen de receptor, de orthosterische agonist en CBD zoals voorgesteld door de dockingstudies voortduren gedurende de dynamische simulatie; (2) veranderingen in de orthostische S1- en allosterische S3-bindingsplaatsen waarnemen en; (3) observeer de interactie tussen residuen F200 en W356 die de ‘twin-tuimelschakelaar’ vormen.

Meer beweging en veranderingen werden waargenomen in de actieve conformatie , dus de simulatietijd werd verlengd tot 50 ns. In algemene termen tonen de resultaten een gecoördineerde beweging die de opening van de cytoplasmatische en extracellulaire zijden genereert en accommodatie van de liganden in de bindingsplaats mogelijk maakt. Analyse van de liganden onthult een gecoördineerde beweging tussen CBD en THC die inhoudt; solvatatie van de blootgestelde terpenische ring van CBD door watermoleculen en vouwen van de MPR over site S3, die samen gedeeltelijke invoer van CBD in de orthosterische bindingsplaats bevorderen en de accommodatie van THC die een L-vormige conformatie aanneemt ( Fig 7 ).

Fig 7. Herrangschikking van oplosmiddelen rond CBD in de agonistisch gebonden CB 1 R.

CBD (oranje), THC (geel) en watermoleculen binnen ≥3 Å in de actieve conformatie van de CB 1 R bij 0 , 25 en 50 ns simulatie.

              https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025.g007

De N-terminale lus gevormd door de C98-C107 disulfidebinding sluit zich over CBD naarmate deze dieper de bindingsplaats binnendringt en gesolvateerd wordt. In deze opstelling werkt CBD hoofdzakelijk samen met het ECL2 en het N-terminale gebied en vormt waterstofbinding met I267 en watermoleculen. Een interactienetwerk tussen de disulfidebinding, CBD en watermoleculen die CBD-toegang tot de bindingsplaats leiden, zou het belang van polaire residuen op posities 98 en 107 kunnen verklaren voor de modulerende effecten beschreven door Laprairie et al .

THC onderhoudt hoofdzakelijk hydrofobe en aromatische interacties; de tricyclische kern vormt aromatische interacties met P177, P189 en P268 terwijl de pentylzijketen zich uitstrekt naar TM 3, 5 en 7. De conformatie van de L- of C-vorm die tijdens de simulatie is aangenomen, is consistent de conformatie voorspeld voor de endogene liganden 2-Arachidonoylglycerol ( 2-AG) en Anandamide (AEA) [ 9 ].

De RMSD-waarden voor elke helix toonden aan dat TM 1 , 2, 6 en 7 waren dynamischer (zie Figuur D in S1-bestand ). Helixes 1 en 2 roteren naar buiten in de extracellulaire zijde terwijl in de intracellulaire zijde helixen 6 en 7 naar buiten bewegen. Rotatie van TM’s 1 en 2 en daaruit voortvloeiende opening in beide zijden van de receptor maakt de expansie van de orthosterische bindingsplaats en de daaropvolgende ligandaccommodatie mogelijk. Fig 8 geeft een overzicht van de gecoördineerde beweging die tijdens de simulatie is waargenomen.

Fig 8. Gecoördineerde beweging waargenomen in de actieve conformatie van de CB 1 R gedurende 50 ns van simulatie.

(A) Grote beweging in de extracellulaire en (B) intracellulaire zijde. CBD (oranje), THC (geel) en watermoleculen binnen ≥3 Å van CBD worden getoond.

              https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025.g008

Analyse van de bindingspockets in de actieve conformatiestatus laat zien dat S1 en S3 zich uitbreiden en combineren in één grotere pocket waar CBD en THC kunnen worden gevonden ( Fig 9 ). De bijdrage van meerdere bindingsplaatsen in het allosterische mechanisme van de cannabinoïde PAM ZCZ011 is beschreven door Saleh et al . [ 61 ] en overlapping van verschillende bindingsplaatsen is ook voorgesteld als een mogelijk mechanisme voor receptormodulatie.

Fig 9. Wijzigingen in de bindingssites S1 en S3 in de actieve conformatie van de CB 1 R na 50 ns simulatie.

Orthostatische site S1 (groen), allosterische site S3 (oranje) en gecombineerde pocket (paars).

              https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025.g009

De aromatische interactie tussen F200 en W356 draagt ​​bij aan de stabilisatie van de receptor in de inactieve toestand maar wordt verstoord in de actieve conformatie [ 10 ]. Deze interactie is beschreven als een dubbele tuimelschakelaar die essentieel is voor receptoractivering, om deze reden werd beweging van deze residuen ook in de simulatie geanalyseerd. Fig 10 toont de afstand tussen TM 3 en 6, de aromatische centroïden van F200 en W356 evenals de dihedrale hoek gevormd door de twee ringvlakken gedurende de simulatietijd.

Fig 10. Twin-tuimelschakelaar interactie.

(A) Interactie tussen F200 en W356 in de actieve conformatie van de CB 1 R gebonden aan THC en CBD. (B) Afstand tussen aromatische centroïden (cyaan) en Ca (rood) van residuen F200 en W356. (C) Dihedrale hoek tussen F200- en W356-ringvlakken gedurende 50 ns simulatie.

              https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025.g010

Analyse van dichtbij gelegen residuen toont een netwerk van polaire threonine (T197, T391) en serine (S199, S203, S390) residuen die de inductie lijken te veroorzaken heroriëntatie van aromatische residuen, terwijl de buitenwaartse rotatie van helix 5 het mogelijk maakt dat TM’s 3 en 6 dichter naar elkaar toe bewegen. Op deze manier worden aan het einde van de simulatie de aromatische ringen van F200 en W356 gescheiden door 1 R de vorming van deze aromatische stof bevordert interactie en kan op deze manier een overgang naar en inactieve receptortoestand veroorzaken.

Een andere dynamische site wordt waargenomen in helix 8 van de receptor (residuen 403-413), een amfipatisch helisch domein binnen de C-terminal dat is geïdentificeerd als een geconserveerd structureel motief in klasse A GPCR’s [ 62 , 63 ]. Tijdens de simulatie roteert helix 8 en oriënteert zijn hydrofobe vlak naar TM 1 ( Fig 11 ). De beweging van een leucineresidu in deze regio is opmerkelijk. L404 7.60 maakt deel uit van het sterk geconserveerde NPXXY (X) 5,6 GPCR-motief en is beschreven als essentieel voor selectieve koppeling aan G-eiwitsubtypen in de CB 1 R [ 64 ]. MD-resultaten tonen aan dat aan het begin van de simulatie L404 naar het cytoplasmatische gebied wijst, maar aan het einde van de simulatie begraaft rotatie van helix 8 dit residu tegen TM 1 ( Fig 11 ). Plaatsgerichte mutagenese-onderzoeken hebben aangetoond dat L404 de internaliseringssnelheid van de receptor reguleert en belangrijk is om maximale receptoractivering te bereiken in reactie op bicyclische cannabinoïde agonisten en omgekeerde antagonisten [ 64 ] . p>

Fig 11. Beweging van helix 8 in de actieve conformatie van de CB 1 R gedurende 50 ns van simulatie.

Residustype wordt aangegeven in kleurcode: zure residuen (rood), basische residuen (blauw), polaire residuen (groen) en niet -polaire residuen (wit). L404 wordt weergegeven in vdW-weergave (paars).

              https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220025.g011

Veranderingen in de oriëntatie van helix 8 samen met verminderde blootstelling van residu L404 in het cytoplasmatische gebied kunnen het NAM-effect van CBD waargenomen door Laprairie verklaren et al . Hoewel de β-arrestine-bindingsplaats en fosforylatieplaatsen die voor de cannabinoïdereceptor zijn beschreven, betrekking hebben op de distale C-terminus (een gebied dat niet is opgenomen in onze receptorstructuren), kan flexibiliteit in de onmiddellijk aangrenzende helix 8 de blootstelling van fosforylatieplaatsen moduleren en op deze manier β veranderen -arrest in werving en receptor internalisatieproces. In overeenstemming met deze opvatting is hoge mobiliteit in helix 8 vereist in de arrestin bindingstoestand met lage affiniteit van de rhodopsinereceptor [ 65 ].

Het dynamische gedrag van helix 8 onderstreept het belang van met een volledige CB1R-structuur die het distale C-terminale gebied omvat. Hoewel de receptormodellen die in dit werk worden gebruikt, de volledige C-terminus missen, leveren ze relevante informatie op die kan helpen bij toekomstige studies.

Div> Div> Div>

Conclusie

In dit werk werd allosterische modulatie van CBD in de CB 1 R bestudeerd op basis van op de mogelijkheid van zijn directe receptorblokkade en het effect ervan op de conformationele veranderingen geassocieerd met de activering en inactivatie van de receptor. Het mechanisme waarmee CBD zijn cannabinoïde-effecten uitoefent, blijft in discussie en hoewel verschillende mechanismen, waaronder allosterische modulatie zijn voorgesteld, is er tot op heden geen bewijs van de directe binding van CBD in een allosterische site van de CB 1 sub > R. p>

Samenvattend tonen de resultaten die in dit werk zijn verkregen aan dat CBD in staat is zich te binden in een allosterische site van de CB 1 R en bevorderen daardoor conformationele veranderingen die kunnen worden geassocieerd met de overgang naar een inactieve of verminderde signaalreceptortoestand. Een allosterische plaats werd geïdentificeerd in de actieve receptorconformatie die CBD op een ligand-specifieke manier kon binden. Wij suggereren dat dipolaire interacties essentieel zijn voor N-terminale beweging en CBD-stabilisatie op de bindingsplaats. MD-simulaties toonden gecoördineerde bewegingen die het openen van de extra en intracellulaire uiteinden van de receptor bevorderden met een daaropvolgende expansie van de bindingsholte vergelijkbaar met een inactieve toestand.

De rol van de extracellulaire en intracellulaire regio’s suggereert dat de opname van beide segmenten belangrijk is voor de studie van allosterische mechanismen. Evenzo zullen verdere studies in de distale C-terminal die de relatie tussen mobiliteit in helix 8 en receptor-internalisatie kunnen bevestigen, nuttig zijn om het mechanisme van CBD-modulatie in de CB 1 beter te begrijpen. Andere auteurs hebben gesuggereerd dat CBD de effecten van THC kan antagoniseren door de interactie ervan met andere moleculaire doelen, zoals de transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1), adenosinereceptor (A 2A ) en serotoninereceptoren ( 5-HT 1A sub>). Voorgestelde mechanismen zijn elders uitgebreid beoordeeld [ 29 ].

Onze onderzoeken stellen ons in staat de binding van CBD te rationaliseren en een mogelijke verklaring voor de effecten te geven van negatieve modulatie waargenomen bij functionele testen. Desondanks sluiten ze niet de mogelijkheid uit van een indirecte modulatie gemedieerd door andere moleculaire doelen die, in combinatie met allosterische binding, bijdragen aan de waargenomen algemene effecten in vivo .

Div>

References

  1. 1.              Matsuda LA, Lolait SJ, Brownstein MJ, Young AC, Bonner TI. Structuur van een cannabinoïdereceptor en functionele expressie van het gekloneerde cDNA. Nature 1990; 346: 561–4. pmid: 2165569
  2. 2.              Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. Moleculaire karakterisering van een perifere receptor voor cannabinoïden. Nature 1993; 365: 61–5. pmid: 7689702
  3. 3.              Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, et al. Internationale Unie van Farmacologie. XXVII. Classificatie van cannabinoïde-receptoren. Pharmacol Rev 2002; 54.
  4. 4.              Busquets Garcia A, Soria-Gomez E, Bellocchio L, Marsicano G. Cannabinoid receptor type-1: de dogma’s breken. F1000Research 2016; 5. pmid: 27239293
  5. 5.              Shore DM, Baillie GL, Hurst DH, Navas F, Seltzman HH, Marcu JP, et al. Allosterische modulatie van een cannabinoïde G-eiwit-gekoppelde receptor. J Biol Chem 2014; 289: 5828-45. pmid: 24366865
  6. 6.              Pertwee RG. Opkomende strategieën voor het exploiteren van cannabinoïde receptoragonisten als medicijnen. Br J Pharmacol 2009; 156: 397-411. pmid: 19226257
  7. 7.              Moreira FA, Grieb M, Lutz B. Centrale bijwerkingen van therapieën op basis van CB1 cannabinoïde receptoragonisten en antagonisten: focus op angst en depressie. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2009; 23: 133–44. pmid: 19285266
  8. 8.              Christopoulos A, Kenakin T. G eiwit-gekoppelde receptor allosterisme en complexering. Pharmacol Rev 2002; 54: 323–74. pmid: 12037145
  9. 9.              Hua T, Vemuri K, Pu M, Qu L, Han GW, Wu Y, et al. Kristalstructuur van de menselijke cannabinoïde receptor CB1. Cell 2016; 167: 750–762.e14. pmid: 27768894
  10. 10.              Hua T, Vemuri K, Nikas SP, Laprairie RB, Wu Y, Qu L, et al. Kristalstructuren van agonist-gebonden menselijke cannabinoïdereceptor CB1. Nature 2017; 547: 468–71. pmid: 28678776
  11. 11.              Shao Z, Yin J, Chapman K, Grzemska M, Clark L, Wang J, et al. Hoge-resolutie kristalstructuur van de menselijke CB1 cannabinoïdereceptor. Nature 2016; 540: 602–6. pmid: 27851727
  12. 12.              Pertwee RG. Endocannabinoïden en hun farmacologische acties. Handb. Exp. Pharmacol., Vol. 231, 2015, p. 1-37. pmid: 26408156
  13. 13.              Nguyen T, Li JX, Thomas BF, Wiley JL, Kenakin TP, Zhang Y. Allosterische modulatie: Een alternatieve aanpak gericht op de Cannabinoid CB1-receptor. Med Res Rev 2017; 37: 441–74. pmid: 27879006
  14. 14.              Prijs MR, Baillie GL, Thomas A, Stevenson LA, Easson M, Goodwin R, et al. Allosterische modulatie van de cannabinoïde CB1-receptor. Mol Pharmacol 2005; 68: 1484–95. pmid: 16113085
  15. 15.              Bauer M, Chicca A, Tamborrini M, Eisen D, Lerner R, Lutz B, et al. Identificatie en kwantificering van een nieuwe familie van peptide-endocannabinoïden (Pepcanen) die negatieve allosterische modulatie op CB1-receptoren vertonen. J Biol Chem 2012; 287: 36944–67. pmid: 22952224
  16. 16.              ​​ Pamplona FA, Ferreira J, Menezes de Lima O, Duarte FS, Bento AF, Forner S, et al. Anti-inflammatoire lipoxine A4 is een endogene allosterische versterker van CB1 cannabinoïde receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109: 21134–9. pmid: 23150578
  17. 17.              Navarro HA, Howard JL, Pollard GT, Carroll FI. Positieve allosterische modulatie van de menselijke cannabinoïde (CB1) -receptor door RTI-371, een selectieve remmer van de dopamine-transporter. Br J Pharmacol 2009; 156: 1178–84. pmid: 19226282
  18. 18.              Horswill JG, Bali U, Shaaban S, Keily JF, Jeevaratnam P, Babbs AJ, et al. PSNCBAM-1, een nieuwe allosterische antagonist bij cannabinoïde CB1-receptoren met hypofagische effecten bij ratten. Br J Pharmacol 2009; 152: 805-14. pmid: 17592509
  19. 19.              Piscitelli F, Ligresti A, La Regina G, Coluccia A, Morera L, Allarà M, et al . Indol-2-carboxamiden als allosterische modulatoren van de Cannabinoid CB 1 -receptor. J Med Chem 2012; 55: 5627–31. pmid: 22571451
  20. 20.              Straiker A, Mitjavila J, Yin D, Gibson A, Mackie K. Streven naar allosterisme: evaluatie van allosterische modulatoren van CB1 in een neuronaal model. Pharmacol Res 2015; 99: 370–6. pmid: 26211948
  21. 21.              Ignatowska-Jankowska BM, Baillie GL, Kinsey S, Crowe M, Ghosh S, Owens RA, et al. Een cannabinoïde CB1-receptor-positieve allosterische modulator vermindert neuropathische pijn in de muis zonder psychoactieve effecten. Neuropsychopharmacology 2015; 40: 2948-59. pmid: 26052038
  22. 22.              Vallée M, Vitiello S, Bellocchio L, Hébert-Chatelain E, Monlezun S, Martin-Garcia E et al. Pregnenolone kan de hersenen beschermen tegen cannabisintoxicatie. Science 2014; 343: 94–8. pmid: 24385629
  23. 23.              Ross R. Allosterism en cannabinoïde CB1-receptoren: de vorm van dingen die nog komen. Trends Pharmacol Sci 2007; 28: 567-72. pmid: 18029031
  24. 24.              Pertwee RG, Gill EW, Paton WDM. Voorlopige experimenten over de chemie en farmacologie van cannabis. Nature 1970; 228: 134–6. pmid: 5466704
  25. 25.              Russo EB. Taming THC: potentiële cannabissynergie en phytocannabinoïde-terpenoïde entourage-effecten. Br J Pharmacol 2011; 163: 1344-64. pmid: 21749363
  26. 26.              Russo E, Guy GW. Een verhaal over twee cannabinoïden: de therapeutische reden voor het combineren van tetrahydrocannabinol en cannabidiol. Med Hypotheses 2006; 66: 234–46. pmid: 16209908
  27. 27.              Mechoulam R, Peters M, Murillo-Rodriguez E, Hanuš LO. Cannabidiol – recente ontwikkelingen. Chem Biodivers 2007; 4: 1678–92. pmid: 17712814
  28. 28.              McPartland JM, Russo EB. Cannabis en cannabisextracten. J Cannabis Ther 2001; 1: 103–32.
  29. 29.              McPartland JM, Pruitt PL. Bijwerkingen van geneesmiddelen die niet worden veroorzaakt door vergelijkbare kruidengeneesmiddelen: het geval van tetrahydrocannabinol en marihuana. Altern Ther Health Med 1999; 5: 57–62.
  30. 30.              McPartland JM, Duncan M, Di Marzo V, Pertwee RG. Zijn cannabidiol en Δ (9) -tetrahydrocannabivarine negatieve modulatoren van het endocannabinoïde systeem? Een systematische review. Br J Pharmacol 2015; 172: 737–53. pmid: 25257544
  31. 31.              Laprairie RB, Bagher AM, Kelly MEM, Denovan-Wright EM. Cannabidiol is een negatieve allosterische modulator van de cannabinoïde CB1-receptor. Br J Pharmacol 2015; 172: 4790-805. pmid: 26218440
  32. 32.              Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, et al. UCSF Chimera — Een visualisatiesysteem voor verkennend onderzoek en analyse. J Comput Chem 2004; 25: 1605–12. pmid: 15264254
  33. 33.              Holtfrerich A, Hanekamp W, Lehr M. (4-Phenoxyphenyl) tetrazolecarboxamiden en verwante verbindingen als dubbele remmers van vetzuuramidehydrolase (FAAH) en monoacylglycerollipase (MAGL). Eur J Med Chem 2013; 63: 64–75. pmid: 23455058
  34. 34.              Wiederstein M, Sippl MJ. ProSA-web: interactieve webservice voor het herkennen van fouten in driedimensionale eiwitstructuren. Nucleic Acids Res 2007; 35: W407-10. pmid: 17517781
  35. 35.              Melo F, Devos D, Depiereux E, Feytmans E. ANOLEA: een www-server om eiwitstructuren te beoordelen . Proceedings Int Conf Intell Syst Mol Biol 1997; 5: 187–90.
  36. 36.              Laskowski RA, MacArthur MW, Moss DS, Thornton JM. PROCHECK: een programma om de stereochemische kwaliteit van eiwitstructuren te controleren. J Appl Crystallogr 1993; 26: 283–91.
  37. 37.              Tian W, Chen C, Lei X, Zhao J, Liang J. CASTp 3.0: berekend atlas van oppervlaktetopografie van eiwitten. Nucleic Acids Res 2018; 46: W363–7. pmid: 29860391
  38. 38.              Volkamer A, Kuhn D, Rippmann F, Rarey M. DoGSiteScorer: een webserver voor automatisch bindende site voorspelling, analyse en beoordeling van de druggabiliteit. Bio-informatica 2012; 28: 2074–5. pmid: 22628523
  39. 39.              Morris GM, Huey R, Lindstrom W, Sanner MF, Belew RK, Goodsell DS, et al. AutoDock4 en AutoDockTools4: geautomatiseerd docken met selectieve receptorflexibiliteit. J Comput Chem 2009; 30: 2785–91. pmid: 19399780
  40. 40.              Sanner MF. Python: een programmeertaal voor software-integratie en ontwikkeling. J Mol Graph Model 1999; 17: 57–61. pmid: 10660911
  41. 41.              Humphrey W, Dalke A, Schulten K. VMD: visuele moleculaire dynamiek. J Mol Graph 1996; 14: 33–8, 27–8. pmid: 8744570
  42. 42.              Zoete V, Cuendet MA, Grosdidier A, Michielin O. SwissParam: een snelle tool voor het genereren van krachtvelden voor kleine organische moleculen. J Comput Chem 2011; 32: 2359-68. pmid: 21541964
  43. 43.              Lomize MA, Pogozheva ID, Joo H, Mosberg HI, Lomize AL. OPM-database en PPM-webserver: middelen voor het positioneren van eiwitten in membranen. Nucleic Acids Res 2012; 40: D370–6. pmid: 21890895
  44. 44.              Phillips JC, Braun R, Wang W, Gumbart J, Tajkhorshid E, Villa E, et al. Schaalbare moleculaire dynamiek met NAMD. J Comput Chem 2005; 26: 1781–802. pmid: 16222654
  45. 45.              Essmann U, Perera L, Berkowitz ML, Darden T, Lee H, Pedersen LG. Een Ewald-methode met gladde deeltjes. J Chem Phys 1995; 103: 8577-93.
  46. 46.              Fay JF, Farrens DL. Het membraan proximale gebied van de cannabinoïde receptor CB 1 N-Terminus kan allosterisch ligandaffiniteit moduleren. Biochemie 2013; 52: 8286–94. pmid: 24206272
  47. 47.              Andersson H, D’Antona AM, Kendall DA, Von Heijne G, Chin C-N. Membraanassemblage van de cannabinoïde receptor 1: impact van een lange N-terminale staart. Mol Pharmacol 2003; 64: 570-7. pmid: 12920192
  48. 48.              Murphy JW, Kendall DA. Integriteit van extracellulaire lus 1 van de menselijke cannabinoïdereceptor 1 is kritisch voor binding met hoge affiniteit van het ligand CP 55.940 maar niet SR 141716A. Biochem Pharmacol 2003; 65: 1623–31. pmid: 12754098
  49. 49.              Ulfers AL, McMurry JL, Kendall DA, Mierke DF. Structuur van de derde intracellulaire lus van de menselijke cannabinoïde 1-receptor. Biochemistry 2002; 41: 11344–50. pmid: 12234176
  50. 50.              Ulfers AL, McMurry JL, Miller A, Wang L, Kendall DA, Mierke DF. Cannabinoïde receptor-G-eiwit interacties: Ga1-gebonden structuren van IC3 en een mutant met veranderde G-eiwitspecificiteit. Protein Sci 2009; 11: 2526–31. pmid: 12237474
  51. 51.              Liu Y, Chen L-Y, Zeng H, Ward R, Wu N, Ma L, et al. Beoordeling van de realtime activering van de cannabinoïde CB1-receptor en de bijbehorende structurele veranderingen met behulp van een FRET-biosensor. Int J Biochem Cell Biol 2018; 99: 114–24. pmid: 29626639
  52. 52.              Liu Y, Chen L-Y, Zeng H, Ward R, Wu N, Ma L, et al. Beoordeling van de realtime activering van de cannabinoïde CB1-receptor en de bijbehorende structurele veranderingen met behulp van een FRET-biosensor. Int J Biochem Cell Biol 2018; 99: 114–24. pmid: 29626639
  53. 53.              Shao Z, Yin J, Chapman K, Grzemska M, Clark L, Wang J, et al. Hoge-resolutie kristalstructuur van de menselijke CB1 cannabinoïdereceptor. Nature 2016; 540: 602–6. pmid: 27851727
  54. 54.              Shim J-Y. Inzicht in functionele residuen van de cannabinoïde CB1. Curr Top Med Chem 2010; 10: 779–98. pmid: 20370713
  55. 55.              Venkatakrishnan AJ, Deupi X, Lebon G, Heydenreich FM, Flock T, Miljus T, et al. Verschillende activeringsroutes in klasse A GPCR’s komen samen in de buurt van het G-eiwit-koppelingsgebied. Nature 2016; 536: 484–7. pmid: 27525504
  56. 56.              Ulfers AL, McMurry JL, Miller A, Wang L, Kendall DA, Mierke DF. Cannabinoïde receptor-G-eiwit interacties: G (alfai1) -gebonden structuren van IC3 en een mutant met veranderde G-eiwitspecificiteit. Protein Sci 2002; 11: 2526–31. pmid: 12237474
  57. 57.              Gentry PR, Sexton PM, Christopoulos A. Nieuwe allosterische modulatoren van G-eiwit-gekoppelde receptoren. J Biol Chem 2015; 290: 19478–88. pmid: 26100627
  58. 58.              Sabatucci A, Tortolani D, Dainese E, Maccarrone M. In silico mapping van allosterische ligandbindingsplaatsen in type 1 cannabinoïde receptor. Biotechnol Appl Biochem 2018; 65: 21–8. pmid: 28833445
  59. 59.              Laprairie RB, Bagher AM, Kelly MEM, Denovan-Wright EM. Cannabidiol is een negatieve allosterische modulator van de cannabinoïde CB 1 -receptor. Br J Pharmacol 2015; 172: 4790-805. pmid: 26218440
  60. 60.              Fay JF, Farrens DL. Het membraan proximale gebied van de cannabinoïde receptor CB1 N-terminus kan allosterisch de ligandaffiniteit moduleren. Biochemie 2013; 52: 8286–94. pmid: 24206272
  61. 61.              Saleh N, Hucke O, Kramer G, Schmidt E, Montel F, Lipinski R, et al. Meerdere bindingsplaatsen dragen bij aan het mechanisme van gemengde agonistische en positieve allosterische modulatoren van de cannabinoïde CB1-receptor. Angew Chemie Int Ed 2018; 57: 2580-5. pmid: 29314474
  62. 62.              Choi G, Guo J, Makriyannis A. De conformatie van de cytoplasmatische helix 8 van de CB1 cannabinoïdereceptor met behulp van NMR en circulair dichroïsme. Biochim Biophys Acta — Biomembr 2005; 1668: 1–9. pmid: 15670725
  63. 63.              Ahn KH, Nishiyama A, Mierke DF, Kendall DA. Hydrofobe residuen in helix 8 van cannabinoïdereceptor 1 zijn kritisch voor structurele en functionele eigenschappen. Biochemie 2010; 49: 502–11. pmid: 20025243
  64. 64.              Anavi-Goffer S, Fleischer D, Hurst DP, Lynch DL, Barnett-Norris J, Shi S et al. Helix 8 Leu in de CB1 cannabinoïdereceptor draagt ​​bij aan selectieve signaaltransductiemechanismen. J Biol Chem 2007; 282: 25100–13. pmid: 17595161
  65. 65.              Kirchberg K, Kim TY, Moller M, Skegro D, Dasara Raju G, Granzin J, et al . Conformationele dynamiek van helix 8 in de GPCR-rhodopsine regelt de activering van arrestine in het desensibilisatieproces. Proc Natl Acad Sci 2011; 108: 18690-5. pmid: 22039220

Leave a Comment